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一、色譜柱基本知識

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10um等，柱效理論值可達(dá)5～16萬／米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10～30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，也要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

1.柱的構(gòu)造

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70Kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2-20um(5-10um),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

2.柱的發(fā)展方向

因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3～10cm，填料粒徑2～3um。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（MICROBORE）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC－MS聯(lián)用。

但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1～100ul/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因進(jìn)樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學(xué)檢測幫質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。

3.柱的填充

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度>20um時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒<20um時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：①高壓勻漿法，多有用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法，柱填充的技術(shù)性強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用己填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是否合理。

二、液相色譜柱規(guī)格

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類

①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm,柱長10~30cm；

②窄徑柱（narrowbore），內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；

③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；

④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；

⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；

⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。

三、色譜柱了解

1）平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)柱壓越高(滲透性差)顆粒分布

顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性差)

顆粒形狀球型∶柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻

無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻流動(dòng)相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)展

2）鍵合相化學(xué)

1.影響化合物的分離度

2.不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同

3.可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同如：C18、C8、CN

3）含碳量

1.含碳量越高，k‘值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）

2.高含碳量 有利于不易保留的化合物的分離、水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好、有利于極性化合物的拖尾改善

3.低含碳量 有利于分析中性及堿性化合物、降低溶劑損耗、填料的端基封口、封口殘余硅羥基、減少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

不同色譜柱的含碳量如下所示：

4）填料的端基封口

封口殘余硅羥基、減少不可逆吸附或拖尾、增加碳含量（0.1%-1%）

5）硅膠的活性

主要影響堿性化合物的保留行為：k'，生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不同，硅膠活性也不同，是選擇性差異的主要來源，硅膠的雜質(zhì)含量，重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小，是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志，填料的穩(wěn)定性，硅膠填料，pH：2-8，聚合物填料，pH：2-12，pH值小于2時(shí)，鍵合相水解，液相色譜法能否將某一樣品完全分離，主要取決于色譜柱的選擇性和柱效，這在很大程度上取決于固定相的選擇是否適當(dāng)。

6）色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、檢測的靈敏度、樣品的容量

長度、分離度，理論塔板數(shù)、速度、樣品的容量、檢測的靈敏度

7）柱性能評價(jià)：購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。

一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。